Особенности экспрессии Iba1 в первичной соматосенсорной коре головного мозга крыс с экспериментальным сахарным диабетом первого типа

Полный текст

Сахарный диабет (СД) – это полиэтиологическое хроническое заболевание, характеризующееся нарушением углеводного обмена и проявляющееся высоким уровнем глюкозы в крови. Гипергликемия ведет к развитию макро- и микроангиопатии и, как следствие, приводит к повреждению органов-мишеней, включая головной мозг. СД рассматривается в качестве важнейшей нозологической причины снижения когнитивных функций [1].

Диабетическая энцефалопатия (ДЭ) является осложнением длительного течения СД на фоне процессов нейродегенерации головного мозга и клинически проявляется когнитивными расстройствами и деменцией [2]. В патогенез ДЭ включается процесс воспаления.

Нейровоспаление – сложный воспалительный процесс в центральной нервной системе, в регуляции которого участвуют микроглиальные клетки. Микроглия – клетки иммунной системы в головном мозге, которые представлены резидентными и свободными макрофагами. Функция микроглии заключается в поддержании гомеостаза посредством постоянного иммунного надзора микросреды, поэтому микроглия чрезвычайно чувствительна к любым метаболическим изменениям. Активация микроглии может оказывать как нейропротективный эффект, так и способствовать повреждению структур головного мозга. При воздействии патологических стимулов клетки микроглии запускают окислительный стресс, что опосредует нейродегенерацию [3]. Активация нейровоспаления начинается с миграции микроглии в очаг повреждения. Морфология микроглии в головном мозге человека при патологическом состоянии напрямую связана с ее функциональным состоянием. В состоянии покоя микроглия находится в неподвижном состоянии и представлена клетками в виде «паучков» с округлыми или овальными телами и тонкими, длинными, разветвленными отростками, которые постоянно сканируют, осуществляют мониторинг внутренней среды. Это состояние позволяет им мгновенно реагировать на патологический стимул и трансформироваться в промежуточный и активированный фенотип.

Промежуточная микроглия отличается более крупными размерами с толстыми короткими отростками, которые отходят от тела толстым пучком. Активированный тип клеток микроглии имеет характерную амебоидную форму за счет увеличения объема перинуклеарной цитоплазмы, укорочения и утолщения отростков. Активированная микроглия характеризуется высокой фагоцитарной активностью и усиленным синтезом цитокинов [4].

Белок Iba1 – наиболее широко используемый иммуногистохимический маркер микроглии. Iba1 позволяет дифференцировать все морфологические формы микроглии: покоящуюся, промежуточную и активированную за счет равномерной экспрессии ИРМ Iba1 в глиальных клетках. Все это обусловливает широкое использование Iba1 в качестве маркера для изучения этой клеточной популяции. В норме морфология микроглиальных клеток соответствует состоянию покоя (наблюдающая или покоящаяся микроглия). При длительном воздействии патологических факторов клетки микроглии могут длительное время пребывать в активированном состоянии, формируя группы клеток микроглии вокруг нейронов с последующим их повреждением и гибелью, что называется «реактивным микроглиозом».

Реактивный микроглиоз – это состояние, при котором при активации микроглии обратимо поврежденные нейроны выделяют хемоаттрактанты, за счет чего в очаг повреждения мигрирует еще больше активированной микроглии, что способствует усилению процессов нейродегенерации [5]. Выявлено, что моноциты проникают в головной мозг, приобретают новый набор антигенов и таким образом трансформируются в микроглиальные клетки [6]. Кроме того, часть микроглии имеет мезодермальное или нейроэктодермальное происхождение [7].

При нейродегенеративных процессах отмечалось достоверное снижение экспрессии Iba1 в коре головного мозга человека, что говорит об «истощении» микроглии с преимущественным наличием промежуточного фенотипа [8]. Данные об экспрессии Iba1 в головном мозге крыс с экспериментальным СД противоречивы: одни исследования подтверждают повышение уровня экспрессии Iba1 в головного мозге крыс с экспериментальным СД [6], другие исследования указывают на снижение экспрессии ИРМ Iba1 [9].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Учитывая прямую функциональную связь микроглиальных клеток и процессов нейровоспаления, остается актуальным более детальное изучение микроглии в условиях СД 1-го типа. Получение новых данных о морфофункциональном статусе микроглии головного мозга на фоне СД 1-го типа и его фармакокоррекции может способствовать лучшему пониманию молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе развития ДЭ.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальное исследование было произведено на 50 белых беспородных крыс-самок, которые достигли 12-месячного возраста. Животные содержались в стандартных условиях вивария с естественным 12-часовым циклом дня и ночи при температуре воздуха (20 ± 2) ºС, влажности 60 %, свободным доступом к воде и пище. Для изучения отдаленных последствий влияния сахарного диабета 1-го типа на кору головного мозга, моделирование СД 1-го типа проводили в течение 6 мес. Было произведено однократное введение растворенного в цитратном буфере (0,1 М, рН 4,5) стрептозотоцина (Sigma, США) в дозе 60 мг/кг после 48-часовой пищевой депривации внутрибрюшинно.

В исследование были включены животные с уровнем тощаковой (отсутствие корма в течение 4 часов до измерения) гликемии ≥11,1 ммоль/л. Контроль гликемии был произведен через 3 дня и 6 месяцев после инъекции стрептозотоцина. Для измерения уровня гликемии был использован глюкометр Contour TS и тест-полоски (Bayer). Забор крови для контроля гликемии производили из подъязычной вены. В эксперимент были включены 5 групп животных: группа 1 – группа интакта (крысы без СД), группа 2 – СД 1-го типа (СД 1 + физ. р-р), группа 3 – фармакокоррекции аминалоном (СД 1 + аминалон), группа 4 – фармакокоррекции мефаргином (СД 1 + мефаргин), группа 5 – фармакокоррекции сукцикардом (СД 1 + сукцикард). Через 6 месяцев после моделирования патологии в течение 30 дней перорально в виде водных растворов вводили исследуемые производные ГАМК: мефаргин (20 мг/кг), сукцикард (50 мг/кг), а также аминалон (1000 мг/кг). Группе СД 1-го типа без лечения вводили 0,9%-й раствор натрия хлорида. В качестве позитивного контроля использовали крыс без СД (интактных) той же партии животных. После курсового лечения исследуемыми соединениями у наркотизированных хлоргидратом животных был произведен забор образцов тканей коры головного мозга. Головной мозг был фиксирован в течение 24 часов в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (pH 7,4). После чего образцы тканей головного мозга обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой гистологической методике. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 4–5 мкм.

Гистологические срезы фотографировали цифровой камерой AxioCam 305 color (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) на базе микроскопа AxioImager A2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) с использованием объективов ×40.

Выявление кальций-связывающий пептида (Iba1) проводили с помощью иммуногистохимического исследования с использованием кроличьих поликлональных первичных антител к белку Iba1 в соответствии с инструкциями производителя (разведение 1 : 200) (Affinity Biosciences, КНР) и визуализирующей полимерной системы детекции с DAB (Elabsciences, КНР). Определяли относительную площадь, занимаемую иммунопозитивным материалом в первичной соматосенсорной коре.

Выявление кластера дифференцировки 68 (CD68) проводили с помощью иммуногистохимического исследования с использованием кроличьих поликлональных первичных антител против белка CD 68 в соответствии с инструкциями производителя (разведение 1 : 200) (Affinity Bio-sciences, КНР) и визуализирующей полимерной системы детекции с DAB (Elabsciences, КНР). Определяли относительную площадь, занимаемую иммунореактивным материалом (ИРМ) в первичной соматосенсорной коре.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами описательной и аналитической статистики с применением программного обеспечения Prism 6 (GraphPad Software Inc., США). Для каждого показателя определяли значения медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR). Результаты представлены в виде Me (LQ; UQ), где Me – медиана, LQ – значение нижнего квартиля; UQ – значение верхнего квартиля. Распределение количественных показателей оценивали с использованием критерия Шапиро – Уилка. Распределение количественных показателей были оценены с использованием критерия Шапиро – Уилка. Межгрупповые различия оценивали с помощью критерия Краскела – Уоллиса и апостериорного критерия Данна. Различия признавали значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При иммуногистохимическом исследовании (ИГХ) коры головного мозга во всех исследованных образцах коры больших полушарий наблюдали положительную реакцию с первичными антителами к маркеру Iba-1. Наиболее выраженная экспрессия ИРМ Iba-1 наблюдалась во всех исследуемых группах в первичной соматосенсорной коре (ПСС).

При более детальном ИГХ ПСС коры головного мозга группы интакта была выявлена от умеренной до выраженной равномерная цитоплазматическая экспрессия ИРМ Iba-1 в перикаринах и отростках микроглиоцитов. Клетки с экспрессией ИРМ Iba-1 имели тела небольших размеров и ветвящиеся длинные отростки в виде «паучков». В группе интакта также встречались более округлые клетки с короткими отростками и выраженной экспрессией ИРМ.

В группе СД 1-го типа в сравнении с группой интакта снижалась плотность иммунопозитивных клеток. Обращает на себя внимание снижение размеров клеток микроглии в ретроспленальной и моторной коре. Преимущественно наблюдалась экспрессия ИРМ Iba-1 в округлых клетках с короткими отростками, то есть в неразветвленной (активированной) микроглии.

В группе фармакокоррекции плотность ИРМ Iba-1 была ниже, чем в интакте, но больше чем в СД 1. Преимущественная экспрессия ИРМ Iba-1 была представлена разветвленной микроглией. В общем иммуногистохимическая картина в группах фармакокоррекции наиболее схожа с картиной группы интакта, что может говорить об их нейропротективных свойствах.

У крыс группы интакта в ПСС коре относительная площадь ИРМ Iba-1 составила 7,29 % (3,94–12,64), в группе СД 1 – 3,42 % (2,0–7,49), что продемонстрировало достоверное снижение относительной площади ИРМ Iba-1 на 3,87 % в группе СД 1 (p < 0,05). Относительная площадь ИРМ Iba-1 в группе аминалона составила 3,47 % (2,86–7,32), в группе мефаргина – 5, 53 % (3,66–7,07), в группе сукцикарда относительная площадь ИРМ Iba-1 составила 4,4 % (3,1–7,18).

Достоверно значимых различий между группами фармакокоррекции и СД 1 выявлено не было, однако наблюдалась тенденция к схожести иммунофенотипических изменений групп фармакокоррекции и интакта, что может свидетельствовать о нейропротективных свойствах исследуемых соединений.

Многочисленные исследования показывают, что микроглия на начальном этапе оказывает нейропротективный эффект за счет элиминации продуктов распада необратимо поврежденных нейронов, усиления процессов репарации, но со временем эта нейропротекторная функция ослабевает [10]. Длительная активация микроглии может способствовать прогрессированию нейродегенеративных заболеваний, приводит к цитотоксическим эффектам, усиливая повреждение нейронов [4].

Таким образом, в литературе описано как увеличение, так и уменьшение экспрессии ИРМ Iba-1 в ЦНС. Однако большинство литературных данных свидетельствует в пользу увеличения экспрессии ИРМ. Стоит обратить внимание, что подавляющее большинство исследований по моделированию СД были выполнены с участием животных не старше 6 мес. и продолжительность эксперимента не превышала 14–16 недель. Мы изучили кору головного мозга крыс, достигших 12 мес. на момент начала исследования, у которых уже имело место наличие структурных изменений в головном мозге на фоне старения. Старение связано с изменением воспалительного статуса в головном мозге.

С возрастом морфология и количество микроглии также меняются. У людей в процессе старения микроглия приобретает дистрофическую морфологию. Она имеет меньшую разветвленность, сморщивание цитоплазмы и расширение аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума, характеризуется усиленным фагоцитозом в отличие от молодой микроглии, снижением гомеостатической функции [6].

Основная часть работ по изучению микроглии была проведена на грызунах. Микроглия этих животных отличается от микроглии человека более высоким пролиферативным потенциалом и регенераторными способностями. Эти факторы необходимо учитывать при экстраполяции на человека результатов, полученных при исследовании микроглии грызунов [11].

Продолжительность жизни микроглии является решающим моментом в понимании патофизиологии неврологических расстройств. Известны два пути самообновления микроглии: за счет пролиферации резидентной микроглии и трансформации моноцитов костного мозга [6], вероятно, что при старении процессы самообновления микроглии замедляются. Таким образом, совокупное воздействие факторов старения и СД снижают количество микроглиоцитов в ПСС коре головного мозга и, возможно, увеличивают их фагоцитарную активность, что подтверждается данными нашего исследования (снижение относительной плотности ИРМ в группе СД, преимущественная экспрессия ИРМ в виде амебоидной микроглии) и увеличение количества поврежденных нейронов.

По данным литературы, Iba-1 не является панмикроглиальным маркером, и для полной характеристики фенотипа микроглии требуется комбинация нескольких микроглиальных маркеров. CD 68 представляет собой трансмембранный гликопротеиновый белок, экспрессируемый моноцитами человека и тканевыми макрофагами, который указывает на фагоцитарную активность клеток. Его локализация связана с мембранами лизосом, поэтому CD 68 традиционно считают маркером активированной микроглии [12].

Нами было выполнено ИГХ окрашивание CD 68. Экспрессия ИРМ при использовании антител против CD 68 сочеталась с неспецифическим фоновым окрашиванием во всех исследуемых группах и позитивном контроле. Возможно, это связано с применением кроличьих поликлональных антител указанного производителя.

Таким образом, нами обнаружено, что при длительном СД1Т у крыс происходит снижение уровня маркера микроглии Iba-1 в первичной соматосенсорной коре головного мозга, что, по-видимому, связано с истощением микроглиального пула, замедлением процессов самообновления микроглии, активации «остаточной» микроглии в коре головного мозга [6, 13].

Активированная микроглия при СД характеризуется усиленным фагоцитозом [14], что подтверждается морфологическими изменениями формы и размеров микроглиальных клеток.

Предполагается, что возрастные изменения в реакциях микроглии при старении в сочетании с СД приводят к возникновению особенностей нейровоспаления в головном мозге грызунов, что может быть потенциальной мишенью для направленной фармакотерапии диабетической энцефалопатии.

Изучение роли микроглии в процессах нейровоспаления при СД и ДЭ могут привести к обнаружению новых молекулярных мишеней для таргетной терапии этого заболевания.

Результаты нашего исследования позволяют предположить, что исследуемые соединения для фармакокоррекции СД могут быть эффективны при ДЭ (рис. 1, 2).

 

Рис. 1. Динамика изменения относительной площади Iba-1 – иммунореактивного материала в первичной соматосенсорной коре головного мозга. * – различия между группами СД 1-го типа и интакта статистически значимы (Anova-Тест), p < 0,05

 

Рис. 2. Снижение экспрессии Iba в первичной соматосенсорной коре при экспериментальной диабетической энцефалопатии: А – интакт-экспрессия ИРМ в микроглии в виде «паучков»; Б. – СД 1-го типа без лечения – экспрессия ИРМ в виде «амебоидной» микроглии; В – СД 1-го типа с лечением аминалоном; Г – СД 1-го типа с лечением мефаргином; Д – СД 1-го типа с лечением сукцикардом. Иммуногистохимическое исследование, антитела против Iba, докраска гематоксилином. Увеличение ×400. Черные стрелки – разветвленная микроглия. Белые стрелки – неразветвленная микроглия

Об авторах

Алексей Владимирович Смирнов

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Email: alexeysmirnov.volggmu@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5351-6105

доктор медицинских наук, профессор

 

Россия, Волгоград; Волгоград

Иван Николаевич Тюренков

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: fibfuv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7574-3923

доктор медицинских наук, профессор, член корр. РАН

Россия, Волгоград

Айслу Ильнуровна Бисинбекова

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Автор, ответственный за переписку.
Email: aandm08@mail.ru

ассистент кафедры

Россия, Волгоград; Волгоград

Дмитрий Александрович Бакулин

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: mbfdoc@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4694-3066

кандидат медицинских наук

Россия, Волгоград

Мария Рафаэлевна Экова

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Email: maria.ekova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8655-1441

кандидат медицинских наук, доцент

Россия, Волгоград; Волгоград

Юлия Ивановна Великородная

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Email: alta-u@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2976-6352

научный сотрудник

Россия, Волгоград; Волгоград

Оксана Юрьевна Лежнина

Ставропольский государственный медицинский университет

Email: okliz26@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0348-0447

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры анатомии им. В.Ю. Первушина

Россия, Ставрополь

Дмитрий Юрьевич Гуров

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: gurov007@mail.ru

доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии

Россия, Волгоград

Леонид Сергеевич Быхалов

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: leonby-vgd@yandex.ru

доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии

Россия, Волгоград

Список литературы

Дополнительные файлы