Russian Journal of GeneticsRussian Journal of GeneticsГенетика0016-67583034-5103The Russian Academy of Sciences70041010.7868/S3034510325120026ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИReview ArticlePresent-Day Computer-Aided Primer Designing Tools for Non-Coding RNAСОВРЕМЕННЫЕ АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ ДИЗАЙНА ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ НЕКОДИРУЮЩИХ РНКYanishevskayaM. AЯнишевскаяМ. Аyanishevskaya@urcrm.ruBlinovaE. AБлиноваЕ. А-Southern Urals Federal Research and Clinical Center for Medical Biophysics of the FMBAЮжно-Уральский федеральный научно-клинический центр медицинской биофизики ФМБА РоссииChelyabinsk State UniversityЧелябинский государственный университет151220256112VOL 61, NO12 (2025)ТОМ 61, №12 (2025)203008012026Copyright ©; 2025, Russian Academy of SciencesCopyright ©; 2025, Российская академия наук2025Russian Academy of SciencesРоссийская академия наукhttps://rjraap.com/0016-6758/article/view/700410

MicroRNA (miRNA) is a class of non-coding RNA that play the pivotal role in post-transcriptional regulation of expression of genes involved in the control of fundamental cellular processes. Their high diagnostic yield and predictive value in various human diseases predetermined the need for highly specific design of primers for qualitative analysis of the expression of a variety of microRNA. Designing the primers for qualitative assessment of microRNA expression is a challenge in terms of methodology due to short matrix and high homology between the family members. Quite often conventional tools, initially aimed at longer targets, are not efficient enough when working with shorter sequences of mature microRNA. That is why, specialized platforms have been created that are adapted to unique structural and functional properties of microRNA. These platforms ensure exact design of primers that can be reproduced. Current review considers present-day computer-aided software tools specially developed to design primers for short non-coding RNA with emphasis on their functional characteristics and ability to design primers for most commonly used method of qualitative assessment of microRNA expression – Stem-loop RT-PCR.

МикроРНК (миРНК) представляют собой класс некодирующих РНК, играющих ключевую роль в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, участвующих в контроле фундаментальных клеточных процессов. Их высокая диагностическая и прогностическая значимость при различных заболеваниях человека обусловила потребность в высокоспецифичном дизайне праймеров для количественной оценки экспрессии множества миРНК. Проектирование праймеров для количественного анализа экспрессии миРНК представляет собой методологически сложную задачу в связи с короткой длиной матрицы и высокой гомологией между членами семейств. Стандартные инструменты, изначально ориентированные на более длинные мишени, часто оказываются недостаточно эффективными при работе с короткими последовательностями зрелых миРНК. По этой причине были созданы специализированные платформы, адаптированные под уникальные структурные и функциональные особенности миРНК, обеспечивающие точный и воспроизводимый дизайн праймеров. В обзоре рассматриваются современные автоматизированные программные инструменты, специально разработанные для проектирования праймеров к коротким некодирующим РНК, с акцентом на их функциональные характеристики и пригодность для конструирования праймеров к наиболее распространенному методу количественного анализа экспрессии миРНК – Stem-loop ОТ-ПЦР.

microRNART-PCRstem-loopprimersdesignsoftwareweb-toolмикроРНКОТ-ПЦРstem-loopпраймерыдизайнпрограммное обеспечениеweb-инструментФинансирование работы осуществлялось в рамках прикладной научно-исследовательской работы по теме: «Создание системы управления биобанкинтом для молекулярно-генетического изучения лучевой патологии человека» (шифр: «Депозит 2025»)Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 // Cell. 1993. V. 75. № 5. P. 843–854. https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90529-yHa M., Kim V.N. Regulation of microRNA biogenesis // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014. V. 15. № 8. P. 509–524. https://doi.org/10.1038/nrm3838Friedman R.C., Farh K.K.H., Burge C.B., Bartel D.P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs // Genome Res. 2009. V. 19. № 1. P. 92–105. https://doi.org/10.1101/gr.082701.108Jang J.H., Lee T.J. The role of microRNAs in cell death pathways // Yeungnam Univ. J. Med. 2021. V. 38. № 2. P. 107–117. https://doi.org/10.12701/yujm.2020.00836Avraham R., Yarden Y. Regulation of signalling by microRNAs // Biochem. Soc. Trans. 2012. V. 40. № 1. P. 26–30. https://doi.org/10.1042/BST20110623Khameneh S.C., Razi S., Lashanizadegan R. et al. MicroRNA-mediated metabolic regulation of immune cells in cancer: An updated review // Front Immunol. 2024. V. 15. https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1424909Kunze-Schumacher H., Krueger A. The role of microRNAs in development and function of regulatory T cells – lessons for a better understanding of microRNA biology // Front. Immunol. 2020. V. 11. P. 2185. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.02185Bao N., Lye K.W., Barton M.K. MicroRNA binding sites in Arabidopsis class III HD-ZIP mRNAs are required for methylation of the template chromosome // Dev. Cell. 2004. V. 7. № 5. P. 653–662. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2004.10.003Searles C.D. MicroRNAs and cardiovascular disease risk // Curr. Cardiol. Rep. 2024. V. 26. № 2. P. 51–60. https://doi.org/10.1007/s11886-023-02014-1Junn E., Mouradian M.M. MicroRNAs in neurodegenerative diseases and their therapeutic potential // Pharmacol. Ther. 2012. V. 133. № 2. P. 142–150. https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2011.10.002Chakrabortty A., Patton D.J., Smith B.F., Agarwal P. miRNAs: Potential as biomarkers and therapeutic targets for cancer // Genes (Basel). 2023. V. 14. № 7. P. 1375. https://doi.org/10.3390/genes14071375Untergasser A., Cutcutache I., Koressaar T. et al. Primer3-new capabilities and interfaces // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. № 15. P. e115. https://doi.org/10.1093/nar/gks596Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I. et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction // BMC Bioinformatics. 2012. V. 13. P. 134. https://doi.org/10.1186/1471-2105-13-134Li L.C. Designing PCR primer for DNA methylation mapping // Methods Mol. Biol. 2007. V. 402. P. 371–384. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-528-2_19Singh A., Pandey G.K. Primer design using Primer Express® for SYBR Green-based quantitative PCR // Methods Mol. Biol. 2015. V. 1275. P. 153–164. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2365-6_11Lim L.P., Lau N.C., Weinstein E.G. et al. The microRNAs of Caenorhabditis elegans // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 991–1008. https://doi.org/10.1101/gad.1074403Pena J.T., Sohn-Lee C., Rouhanifard S.H. et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues // Nat. Methods. 2009. V. 6. P. 139–141. https://doi.org/10.1038/nmeth.1294Lagos-Quintana M., Rauhut R., Lendeckel W., Tuschl T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs // Science. 2001. V. 294. P. 853–858. https://doi.org/10.1126/science.1064921Chen J., Lozach J., Garcia E.W. et al. Highly sensitive and specific microRNA expression profiling using BeadArray technology // Nucl. Acids Res. 2008. V. 36. № 14. P. e87. https://doi.org/10.1093/nar/gkn387Krichevsky A.M., King K.S., Donahue C.P. et al. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development // RNA. 2004. V. 9. № 10. P. 1274–1281. https://doi.org/10.1261/rna.5980303Balcells I., Cirera S., Busk P.K. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers // BMC Biotechnol. 2011. V. 11. P. 70. https://doi.org/10.1186/1472-6750-11-70Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR // Nucl. Acids Res. 2005. V. 33. № 20. P. e179. https://doi.org/10.1093/nar/gni178Shi R., Chiang V.L. Facile means for quantifying microrRNA expression by real-time PCR // BioTechniques. 2005. V. 39. № 4. P. 519–525. https://doi.org/10.2144/000112010Kramer M.F. Stem-loop RT-qPCR for miRNAs // Curr. Protoc. Mol. Biol. 2011. Chapter 15: Unit15.10. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1510s95Yang L.H., Wang S.L., Tang L.L. et al. Universal stem-loop primer method for screening and quantification of microRNA // PLoS One. 2014. V. 9. № 12. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0115293Wang Y., Zhou J., Chen Y. et al. Quantification of distinct let-7 microRNA family members by a modified stem-loop RT-qPCR // Mol. Med. Rep. 2018. V. 17. № 3. P. 3690–3696. https://doi.org/10.3892/mmr.2017.8297Varkonyi-Gasic E., Wu R., Wood M. et al. Protocol: A highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs // Plant Methods. 2007. V. 3. P. 12. https://doi.org/10.1186/1746-4811-3-12Kang S.T., Hsieh Y.S., Feng C.T. et al. miPrimer: An empirical-based qPCR primer design method for small noncoding microRNA // RNA. 2018. V. 24. № 3. P. 304–312. https://doi.org/10.1261/rna.061150.117Guido N., Starostina E., Leake D., Saaem I. Improved PCR amplification of broad spectrum GC DNA templates // PLoS One. 2016. V. 11. № 6. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156478Rhim J., Baek W., Seo Y., Kim J.H. From molecular mechanisms to therapeutics: Understanding micro-RNA-21 in cancer // Cells. 2022. V. 11. № 18. P. 2791.https://doi.org/10.3390/cells11182791He F., Guan W. The role of miR-21 as a biomarker and therapeutic target in cardiovascular disease // Clin. Chim. Acta. 2025. https://doi.org/10.1016/j.cca.2025.120304Kumarswamy R., Volkmann I., Thum T. Regulation and function of miRNA-21 in health and disease // RNA Biol. 2011. V. 8. № 5. P. 706–713. https://doi.org/10.4161/rna.8.5.16154Busk P.K. A tool for design of primers for micro-RNA-specific quantitative RT-qPCR // BMC Bioinformatics. 2014. V. 15. P. 29. https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-29Balcells I., Cirera S., Busk P.K. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers // BMC Biotechnol. 2011. V. 11. P. 70. https://doi.org/10.1186/1472-6750-11-70Vester B., Wengel J. LNA (locked nucleic acid): High-affinity targeting of complementary RNA and DNA // Biochemistry. 2004. V. 43. № 42. P. 13233–13241. https://doi.org/10.1021/bi0485732Xie S., Zhu Q., Qu W. et al. sRNAPrimerDB: Comprehensive primer design and search web service for small non-coding RNAs // Bioinformatics. 2019. V. 35. № 9. P. 1566–1572. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty852UPL (2017). Universal Probe Library. https://lifescience.roche.com/en_in/brands/universal-probe-library.html.05/06/2017Czimmerer Z., Hulvely J., Simandi Z. et al. A Versatile method to design stem-loop primer-based quantitative PCR assays for detecting small regulatory RNA molecules // PLoS One. 2013. V. 8. № 1. P. e55168. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055168